As infecções fúngicas invasivas, especialmente aquelas causadas por Candida e Aspergillus, apresentam elevada importância clínica e demandam métodos capazes de fornecer informações rápidas sobre a suscetibilidade aos antifúngicos e as características dos isolados. Este estudo avaliou a aplicação da espectrometria de massas MALDI-TOF MS e da espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) na caracterização fenotípica e avaliação da suscetibilidade antifúngica de isolados clínicos. Inicialmente, foram comparados os valores de concentração inibitória mínima (CIM) obtidos pelos métodos CLSI e EUCAST para 73 isolados de Candida spp. frente a fluconazol (FLZ), anfotericina B (AMB), VCZ (VCZ) e anidulafungina (ANF), e para 15 isolados de Aspergillus fumigatus frente a VCZ, itraconazol (ITZ), micafungina (MCF), caspofungina (CSF), AMB e posaconazol (PCZ). Em Candida, foram observadas elevadas concordâncias entre os métodos, com concordância essencial de 95,9%, 94,5%, 97,3% e 100% para FLZ, AMB, VCZ e ANF, respectivamente. Para A. fumigatus, a concordância essencial e categórica para VCZ foi de 100%. O teste de suscetibilidade antifúngica por MALDI-TOF MS (TSAF-MS) foi avaliado em 45 isolados de Candida frente ao FLZ e em isolados de A. fumigatus frente a ITZ e VCZ, utilizando o Índice de Correlação de Compósitos (ICC) para determinação da concentração mínima capaz de alterar o perfil proteico (MPCC). Em Candida, a concordância essencial entre TSAF-MS e EUCAST foi de 100% e entre TSAF-MS e CLSI foi de 97,9%, sem diferença significativa entre os métodos (p = 0,5). A redução do protocolo para 3 horas de exposição ao FLZ, utilizando apenas três concentrações, resultou em concordância categórica de 86,8%. Em A. fumigatus, o protocolo simplificado, com 10 horas de exposição, apresentou concordância categórica de 93,8% para VCZ e 87,5% para ITZ. A análise dos perfis proteicos por MALDI-TOF MS permitiu identificar agrupamentos intraespecíficos em C. auris. C tropicalis e A. fumigatus, mas esses agrupamentos não apresentaram correspondência consistente com os fenótipos de suscetibilidade ou com relações previamente estabelecidas por métodos genotípicos. A análise por FTIR de 9 isolados de C. auris mostrou separação associada ao fenótipo frente à AMB. Em 22 isolados de C. tropicalis, foram observados agrupamentos com concentração de determinados fenótipos de resistência aos azólicos, porém sem separação completa dos isolados segundo a suscetibilidade. Em conjunto, os resultados demonstram que MALDI-TOF MS e FTIR são capazes de fornecer informações fenotípicas complementares sobre isolados clínicos. O TSAF-MS apresentou elevada concordância com os métodos de referência e, mesmo após simplificação dos protocolos, manteve desempenho promissor para avaliação rápida da suscetibilidade antifúngica. Entretanto, as análises de agrupamento por MALDI-TOF MS e FTIR não permitiram discriminar de forma consistente os isolados segundo suas características genéticas ou fenótipos de resistência. Assim, os resultados sustentam o potencial dessas abordagens como ferramentas complementares para a caracterização de fungos e avaliação da suscetibilidade antifúngica, mas reforçam a necessidade de padronização e validação adicional antes de sua aplicação rotineira.