O gênero Bartonella compreende numerosas espécies responsáveis por doenças infecciosas emergentes e reemergentes em humanos e animais. Bartonella henselae, espécie frequentemente associada à doença da arranhadura do gato em humanos, também pode infectar cães, que podem apresentar infecção subclínica ou manifestações clínicas inespecíficas. Esses animais têm sido considerados importantes sentinelas epidemiológicos no contexto da Saúde Única, devido à estreita convivência com seres humanos e ao potencial papel na epidemiologia da infecção. No Brasil, ainda são escassos os estudos que investigam a ocorrência de Bartonella henselae em cães clinicamente assintomáticos utilizando métodos microbiológicos e moleculares combinados. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar a ocorrência de infecção por Bartonella henselae em cães sem sinais clínicos sistêmicos do município de Amparo, SP, por meio de cultura microbiológica e técnicas moleculares. Foram analisadas amostras sanguíneas de 51 cães submetidos a procedimentos eletivos, como castração e profilaxia periodontal, em uma clínica veterinária privada. As amostras foram submetidas à cultura sólida, cultura líquida de enriquecimento e posterior análise molecular por reação em cadeia da polimerase (PCR). Não foi observado crescimento bacteriano em cultura sólida. Entretanto, considerando os resultados obtidos pelos diferentes métodos moleculares, foi identificado DNA de Bartonella henselae em 24 (47,1%) dos cães avaliados. A PCR realizada após cultura líquida de enriquecimento detectou a bactéria em 17 (33,3%) animais, enquanto a PCR realizada diretamente em sangue total identificou 8 (15,7%) animais positivos, evidenciando que a utilização de estratégias diagnósticas complementares aumenta a capacidade de detecção da infecção. Não foram observadas alterações hematológicas consistentes associadas à positividade para B. henselae, indicando que o hemograma, isoladamente, não constitui um marcador confiável da infecção em cães clinicamente assintomáticos. Os resultados reforçam a importância da associação entre cultura de enriquecimento e métodos moleculares para aumentar a sensibilidade diagnóstica da bartonelose canina. Além disso, a elevada frequência de detecção observada em cães clinicamente assintomáticos sugere que a infecção pode estar sendo subdiagnosticada na medicina veterinária, reforçando a necessidade de ampliar a investigação da bartonelose em animais com fatores de risco epidemiológicos e manifestações clínicas compatíveis. Sob a perspectiva da Saúde Única, os achados contribuem para o conhecimento da epidemiologia da infecção por Bartonella henselae no Brasil e ressaltam a importância do fortalecimento das estratégias de vigilância epidemiológica, diagnóstico precoce e controle de ectoparasitas.