O sistema CRISPR/Cas9 é considerado um sistema imunológico adaptativo de procariotos, muito utilizado atualmente em estudos moleculares como ferramenta de edição genômica dirigida em eucariotos. Apesar de tradicionalmente ser reconhecido por sua preferência em atividade de clivagem de moléculas de DNA, estudos anteriores realizados in vitro demonstraram potencial desse sistema na interferência da estabilidade de moléculas de RNA em condições específicas. Apesar disso, estudos para perseguir o entendimento desse mecanismo ficou estagnado e o conhecimento da atividade de Cas9 em moléculas de RNA em nível celular permanece a ser desvendado. Neste estudo, avaliamos pela primeira vez em nível celular a capacidade do sistema CRISPR/Cas9 de interferir em molécula de RNA fita simples de sentido positivo, utilizando como modelo experimental o coronavírus da hepatite murina (MHV-3). Este vírus, tem semelhanças estruturais e fisiológicas com o SARS-CoV2 e contém exclusivamente material genético composto de RNA, desde sua estrutura genômica até o seu processo replicativo. Como prova de conceito, avaliamos a interferência no sucesso infeccioso/replicativo do MHV-3 em células contendo sistema CRISPR/Cas9 como defesa. Células L929 foram transfectadas com construções de CRISPR/Cas9 contendo sgRNAs direcionados a genes essenciais do vírus (NSP3, E) e, em seguida, desafiadas por infecção viral. Ensaios de efeito citopático, análises de viabilidade celular, PCR em tempo real e titulação viral demonstraram que o CRISPR/Cas9 reduziu significativamente a ação viral e preservou a viabilidade celular, sendo o sgRNA direcionado à NSP3 o mais eficaz. Esses resultados demonstraram que o CRISPR/Cas9 pode atuar diretamente sobre o RNA viral, sugerindo uma nova aplicação antiviral desse sistema além de sua função clássica em DNA. Nossos resultados oferecem uma prova de conceito para o desenvolvimento de estratégias baseadas em CRISPR/Cas9 no controle de infecções por vírus de RNA.